シングルセル解析

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シングルセル解析は、細胞を1つひとつ分けて遺伝子発現などの情報を解析する手法です。サンプル全体の平均を見るバルク解析では捉えにくい細胞ごとの違いや、希少な細胞集団を調べられます。ここでは、シングルセル解析の特徴や活用分野、バルク解析との違いなどを紹介します。

シングルセル解析とは

シングルセル解析とは、細胞1つひとつを区別し、それぞれの細胞が持つ遺伝子発現などの情報を解析する手法です。従来のバルク解析では、複数の細胞をまとめて解析するため、サンプル全体の平均的な情報を把握するのに適しています。一方で、細胞ごとの違いや、少数だけ存在する細胞集団の特徴までは見えにくいことがあります。

シングルセル解析では、細胞を1つずつ分けて解析することで、同じ組織やサンプルの中にどのような細胞集団が存在するのか、細胞ごとに遺伝子発現がどう異なるのかを調べることができます。 がん組織や免疫細胞集団など、多様な細胞が存在するサンプルにおいて、細胞集団の構成や状態をより詳細に評価するために用いられています。

特に、次世代シーケンサーを用いたシングルセルRNA-Seqでは、1細胞ごとのRNAを解析し、遺伝子発現の違いを網羅的に調べます。細胞集団の分類や細胞状態の評価、薬剤処理後の細胞応答の解析などに活用されています。

シングルセル解析が活用できる
研究分野・目的の具体例

シングルセル解析は、細胞集団の中にどのような細胞が含まれているのか、細胞ごとにどのような違いがあるのかを調べる目的で活用されます。サンプル全体をまとめて見るだけでは捉えにくい細胞の違いを解析できるため、複雑な組織や多様な細胞が混在するサンプルの研究に適しています。

• がん組織に含まれる細胞集団の解析
• 免疫細胞の種類や状態の解析
• 発生・分化の過程における細胞変化の解析
• 薬剤処理後の細胞ごとの反応の解析
• 希少な細胞集団や新たな細胞タイプの探索

例えばがん研究では、がん細胞だけでなく、免疫細胞や間質細胞などを含む腫瘍微小環境を詳しく調べる目的で活用されます。免疫研究では、免疫細胞の種類や活性化状態を細かく解析することで、細胞集団全体では見えにくい反応の違いを確認できます。

発生・再生医療研究では、細胞が分化していく過程を1細胞レベルで追うことで、どの段階でどの遺伝子が働いているのかを調べやすくなります。創薬研究や薬剤応答解析においても、薬剤に反応する細胞と反応しにくい細胞の違いを把握する手法として活用されています。

シングルセル解析の基本的な手順

シングルセル解析では、まず解析対象となる細胞を準備し、1細胞ごとの情報を取得できる状態に整えます。ここでは、シングルセルRNA-Seqを想定した基本的な流れを紹介します。

サンプル調製・単一細胞の分離

まず、組織や血液などのサンプルから細胞を回収し、1細胞ごとの情報を取得できる状態に調製します。組織サンプルの場合は、細胞同士がまとまった状態から単一細胞の懸濁液にする工程が必要です。

シングルセル解析では、細胞の状態が解析結果に影響するため、サンプルの品質管理が重要です。細胞が壊れていたり、死細胞や細胞断片の割合が高い場合は、取得されるデータ品質に影響を与える可能性があります。そのため、解析前には細胞数や生存率などを確認し、シーケンスに適した状態へ整えます。シーケンスに適した状態で細胞を分離することが不可能な場合は、細胞全体ではなく細胞核を分離してRNAを解析する snRNA-Seq（Single-nucleus RNA sequencing）も選択肢となります。

ライブラリー調製

次に、1細胞ごとのRNAなどを解析できるよう、ライブラリー調製を行います。シングルセルRNA-Seqでは、細胞ごとのRNAをcDNAに変換し、次世代シーケンサーで読み取れる形に整えます。

この工程では、細胞ごとに由来を識別するためのバーコードを付与します。バーコードを付けることで、シーケンス後にどの配列データがどの細胞に由来するものかを判別できます。1細胞ごとの遺伝子発現を解析するために重要な工程です。

シーケンス

作成したライブラリーを次世代シーケンサーで読み取り、塩基配列データを取得します。シーケンスによって得られるデータは、一般的に塩基配列と品質情報を含む「FASTQファイル」として出力されます。

シングルセル解析では、多数の細胞をまとめて解析するため、目的に応じたシーケンス深度やリード数の設計が重要です。研究目的やサンプルの種類に合わせて条件を設定することで必要な情報を効率よく取得できます。

一般的には、1細胞あたり20,000リード前後を目安にシーケンス条件検討を開始します。サンプルあたりの細胞数が多い場合や、低発現遺伝子の解析など、より多くのリード数を必要とする用途では、NovaSeq™ 6000システムやNovaSeq Xシリーズなどのハイスループットシーケンサーが適しています。

一方で、解析対象の細胞数やサンプル数が少ない場合や、細胞タイプのプロファイリングなど探索的な解析を主目的としない場合には、NextSeq™ 1000/2000システムやMiSeq™ i100などのベンチトップシーケンサーで対応可能なケースもあります。

データ解析

シーケンスで得られたデータをもとに、細胞ごとの遺伝子発現量などを解析します。まず、配列データの品質確認を行い、細胞ごとの発現情報を整理します。

その後、発現パターンが似ている細胞をグループに分けクラスタリングや、細胞タイプの推定、細胞集団間の発現差解析などを行います。これにより、サンプル内にどのような細胞集団が存在するのか、特定条件下における細胞集団の応答や変化を評価できます。

バルク解析とシングルセル解析の違い

バルク解析とシングルセル解析の大きな違いは、細胞をまとめて解析するか、1細胞ごとに解析するかです。

バルク解析は、複数の細胞をまとめて解析する方法です。組織や細胞集団から抽出したDNAやRNAをまとめて読み取るため、サンプル全体としてどのような特徴があるのかを比較的安価に把握するのに向いています。

一方、シングルセル解析は、細胞を1つひとつ分けて解析する方法です。細胞ごとの情報を取得できるため、細胞集団の中にあるばらつきや、少数しか存在しない細胞集団を確認しやすくなります。

サンプル全体の傾向を把握したい場合はバルク解析、細胞ごとの違いや細胞集団の多様性まで詳しく見たい場合はシングルセル解析が向いています。研究目的に応じて、どちらの手法を選ぶかを検討することが重要です。

シングルセル解析の主な手法

シングルセル解析には、解析対象や研究目的に応じていくつかの手法があります。ここでは、次世代シーケンサーを用いた代表的な手法を紹介します。

シングルセルRNA-Seq

シングルセルRNA-Seqは、1細胞ごとのRNAを解析し、遺伝子発現の違いを調べる手法です。細胞ごとにどの遺伝子がどれくらい発現しているかを確認できるため、細胞タイプの分類や細胞集団ごとの状態の違いを把握する目的で用いられます。

例えば、がん研究や免疫研究、発生・分化の研究など複数の細胞が混在するサンプルを詳しく調べたい場合に活用されます。シングルセル解析の中でも特に広く用いられている手法です。

シングルセルATAC-Seq

シングルセルATAC-Seqは、1細胞ごとにクロマチンの開いている領域を解析する手法です。クロマチンとは、DNAとタンパク質が結びついた構造のことで遺伝子の働きやすさに関わります。

この手法では、細胞ごとにどのゲノム領域がアクセスしやすい状態になっているかを調べることで、遺伝子発現制御に関連するクロマチン状態の解析に利用されています。遺伝子発現そのものを見るシングルセルRNA-Seqとは異なり、遺伝子発現を制御する領域に着目する点が特徴です。

シングルセルマルチオーム解析

シングルセルマルチオーム解析は、1細胞から複数種類の情報を同時に解析する手法です。例えば、同じ細胞から遺伝子発現情報とクロマチンの状態を取得することで、細胞ごとの特徴をより深く理解できる手法です。

シングルセルマルチオーム解析は、シングルセルRNA-Seqだけでは見えにくい制御の仕組みや、細胞の分化・状態変化を詳しく調べたい場合に役立ちます。複数の解析情報を組み合わせることで、細胞ごとの特徴を多面的に解析するためのアプローチです。