遺伝子発現解析（RNA-Seq）
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次世代シーケンサーは、DNAやRNAの塩基配列を、高速かつ大量に並行処理するための技術です。ここでは特にRNA分子の解析に用いられる「RNA-Seq」について、用途や手順、他の手法との比較などをご紹介します。
遺伝子発現解析
「RNA-Seq」とは
RNA-Seqとは、次世代シーケンサーを用いてRNAの塩基配列を解析する手法の一つです。RNA分子は細胞をはじめとする生物由来組織に存在し、DNAからタンパク質合成への遺伝情報を伝達する上で重要な役割を果たします。
解析ターゲットとするRNAの種類にもよりますが、特に真核生物の成熟mRNA（別名メッセンジャーRNA・コーディングRNA）を濃縮して読み取り、解析を行う方法が一般的です。近年では個々の細胞の遺伝子発現パターンを網羅的に調べる「シングルセルRNA-Seq」と区別する目的から、「バルクRNA-Seq」や「mRNA-Seq」と呼ばれることもあります。
RNA-Seqが活用できる
研究分野・目的の具体例
RNA-Seqは、主にDNAがRNAを通し、タンパク質に変換される工程での「遺伝子発現解析」に使用されます。遺伝子発現解析とは、遺伝情報の中で「どの遺伝子がどれくらい使われているか」を調べる手法です。
- 新規遺伝子（転写産物）や変異の発見
- バイオマーカー探索（疾患特異的な転写産物や変異を指標として抽出）
- 融合遺伝子・スプライシング異常の解析
- 疾患の発生や薬剤処理後の時間経過に伴う発現変化を解析
また、RNA-Seqの場合は特定の状況下にあるRNA分子を網羅的に解析することも可能なため、上記のようなケースでの活用も考えられるでしょう。活用可能な分野としても、臨床や環境、基礎研究など多岐に渡ります。
RNA-Seqの基本的な手順
RNA-Seqを行う際には、まず生物由来の生体組織サンプルを用意し、RNAを抽出します。では、その後の具体的な手順について見ていきましょう。
ライブラリー調製
RNAをシーケンス可能な形に整える工程です。ここではRNAからcDNA（相補的DNA）へ変換する「逆転写」や、cDNAを適度な長さに切断する「断片化」などを行います。
シーケンス
作成したライブラリーを次世代シーケンサーで読み取り、データを取得します。結果は塩基配列とそのクオリティスコアを示した「FASTQファイル」が一般的です。
データ解析
得られた発現データを基に、遺伝子発現量などを解析します。
次世代シーケンサーの操作にハードルを感じ、受託サービスを検討する研究者もいるかと思います。操作不要であることや初期費用の観点から受託サービスを選択するケースもありますが、運用頻度や研究体制によっては、装置を購入した方がメリットが大きい場合もあります。
当サイトでは受託ではなく購入する価値やはじめて次世代シーケンサーを購入する方におすすめのシステムも解説しているので併せて参考にしてください。
従来の方法との比較
RNA-Seqとマイクロアレイの比較
従来遺伝子発現解析に使用されていた「マイクロアレイ」と比較すると、RNA-Seqは「新規転写産物の検出が可能」であることや、「より高い感度で、低発現の遺伝子抽出が可能」などのメリットがあります。
また、希少で数が少ない転写産物に関しても抽出できるため、更に精度に優れたシーケンス解析が期待できるでしょう。
RNA-SeqとqRT-PCRの比較
RNA-Seqと似た手法として、qRT-PCRがあります。これは特定、かつ少量の遺伝子の発現を定量するのに向いているのが特徴です。しかし、新規転写産物の検出はできません。
それに対し、RNA-Seqは新規転写産物の検出が可能なほか、細胞に存在する全てのmRNAを網羅的に解析できます。複数の遺伝子を同時にシーケンスするような場合でも、RNA-Seqの方が適していると言えるでしょう。
RNA-Seqの主な手法
最後に、RNA-Seqに用いられる主な手法についてご紹介します。
mRNAシーケンス
mRNAシーケンスは、高感度かつ正確な遺伝子の定量が可能。同じ遺伝子でも異なる働きをするものや、別々の遺伝子が統合し異常な遺伝子になる「融合遺伝子」、父母どちらの遺伝子が多く使われているかの「アレル特異的発現」など、遺伝子の働き方や異常などの発見にも適しています。
ターゲットRNAシーケンス
あらかじめ目的とする特定の遺伝子群にフォーカスし、遺伝子発現を解析する方法です。主に目的のRNAだけを引き寄せて集める「エンリッチメント法（濃縮法）」と、特定の遺伝子領域を増幅（コピー）する「アンプリコン法（増幅法）」に分けられます。
RNAエクソームキャプチャー
シーケンス
タンパク質を作るためのコーディング領域のみを選び、詳しく調べられるのが特徴です。全体を読むよりもコストを抑えつつ、重要な部分だけを高精度に解析することが可能です。サンプルが低品質な場合や、出発物質が限られている場合などにも効果を発揮します。
トータルRNAシーケンス
遺伝子や転写物の量を正確に測定し、コーディングRNAだけでなく、タンパク質を作らないノンコーディングRNAについても既知、もしくは新規の特徴を検出できます。複数の種類のノンコーディングRNAの解析も可能です。
Small RNAシーケンス
ノンコーディングRNAが、遺伝子サイレンシングや遺伝子発現の転写後制御においてどのような役割をするかを調べる目的で実施されます。具体的にはmicroRNA等のsmall RNAを単離、配列する方法が用いられるのが一般的です。
RNAシーケンスは、DNA変異解析に次いで人気のアプリケーションで、多くの研究者の方が取り組まれています。実験計画をたてる際に注意すべき点や解析方法など、RNAシーケンスをはじめるにあたって不安な点などあれば、お気軽にイルミナにご相談ください。
「次世代シーケンサーのすゝめ」
次世代シーケンサーは未来の研究や製品開発の可能性を広げる重要な装置です。しかし、初めて次世代シーケンサーを導入する方にはハードルが高く感じられるケースも少なくありません。
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